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螺旋藻的急性和亚慢性毒性试验

来源:广西畜牧兽医学会养猪分会   
李晓玉1,陈忠伟2,赵武2,段群棚2,张宁3,郭旋3,蒋家霞4,林昌华4,胡庭俊1*,何颖2*
(1.广西大学动物科学技术学院,广西  南宁  530005;2.广西兽医生物技术重点实验室,
广西  南宁  530001;3.广西农垦永新畜牧集团金光有限公司,广西  南宁  530022;
4.广西农垦永新畜牧集团新兴有限公司,广西  柳州  545112)
 
摘  要:[目的]旨在评价螺旋藻的毒性,为临床安全用药提供理论依据。[方法]以昆明小鼠为研究对象,进行急性和亚慢性毒性试验。在急性毒性试验中,采用不同浓度的螺旋藻水溶液进行小鼠灌胃来测定螺旋藻的半数致死量和最大耐受量;在亚慢性毒性试验中,小鼠以(10.0、5.0、2.5 g/kg)不同剂量连续饲喂28d,在给药第28天观察小鼠的临床体征、体重及饲料利用率、白细胞总数、血液生化指标和病理组织学变化。[结果]急性毒性试验各剂量组小鼠均无死亡,无法测出LD50,最大耐受量为10g/kg。亚慢性毒性试验中用药组小鼠的临床体征、体重及饲料利用率、白细胞计数、血液生化指标与空白对照组小鼠相比,无显著差异(P>0.05),组织病理学观察,实质器官无异常病变。[结论]螺旋藻实际无毒,安全性好。
关键词:螺旋藻;毒性试验;小鼠
 
螺旋藻(Spirulina)不仅营养丰富均衡,而且很容易被消化吸收,它含有很多生物活性成分,如机体所需的氨基酸种类、藻蓝蛋白、螺旋藻多糖、β-胡萝卜素、叶绿素和维生素等[1],这些活性成分具有很重要的药理活性,如提高机体免疫力、促进抗氧化、抗炎、防治高脂血症、抗贫血以及促进骨髓造血作用等[2-3]。研究发现,螺旋藻主要通过螺旋藻多糖和藻蓝蛋白对机体免疫产生调节作用[4]。徐娇红等[5]研究发现,螺旋藻多糖对小鼠的体液免疫和NK细胞活性均有增强作用。另外,螺旋藻多糖还可通过促进骨髓细胞的增殖来发挥免疫调节作用[6],藻蓝蛋白能够促进聚羟基脂肪酸酯刺激的淋巴细胞的转化功能[7]。还有研究表明,无论在体内还是内外,藻蓝蛋白都可以抑制脂质体过氧化反应[8],具有抗氧化生物活性、减轻炎症的功能[9-11]。目前,畜禽免疫抑制性疾病的流行给世界畜牧业带来了严重的经济损失,同样,当机体处于氧化应激时所产生过量的氧自由基会导致机体组织器官的衰老或引发疾病,因此,螺旋藻在兽用方面的深入研究对当前畜禽免疫抑制性疾病的防治以及在动物健康养殖中具有重要意义。为确保螺旋藻在临床动物使用上的安全性,该试验进行了螺旋藻急性及亚慢性毒性试验,并研究了不同剂量螺旋藻水溶液对小鼠的临床体征、体重及饲料利用率、白细胞分类计数、血液生化指标和病理组织学变化的影响,以观察螺旋藻是否具有毒副作用及可能出现的毒副作用反应,旨在为螺旋藻能否应用于动物临床提供依据。
1  材料与方法
1.1  材料
1.1.1   实验动物:SPF昆明小鼠,雌雄各半,体重20~25g。雌雄各半,购于广西医科大学实验动物中心。环境及鼠笼消毒后,于购买后新环境下适应饲养喂养3 d,以减少应激,每天人工照明12 h。灌胃前禁食8~12 h,不限制饮水。
1.1.2  受试药品:螺旋藻粉末,由北海生巴达生物科技有限公司提供,中国科学院水生物研究所监制。
1.2  方法
1.2.1  半数致死量测定:选用8周龄、体重为20~25 g昆明种小鼠16只,随机分成4组,每组4只,分笼饲养。参考药物安全性评价及螺旋藻粉末最大溶解度设10、5、2.5、1.25 g/kg4个剂量组。试验前12 h禁食,自由饮水。试验开始第1天,在24 h内分3次,每次0.8 mL螺旋藻水溶液(螺旋藻粉末溶于蒸馏水)对小鼠进行灌胃给药。记录小鼠采食、饮水量变化和是否有中毒或死亡的症状,观察中毒特点及中毒效果特性的变化,并在第8天,全部断颈处死,肉眼观察小鼠的肝﹑心、脾﹑肺﹑肾﹑及胃肠道有无眼观上的病理变化。若无异常,进行急性毒性最大耐受量试验。
1.2.2  最大耐受量试验:选用8周龄、体重为20~25 g昆明小鼠20只。试验前12 h断粮,自由采水。试验开始24 h内分3次,每次0.8 mL螺旋藻水溶液给灌胃给药,剂量为10 g/kg(螺旋藻粉末最大溶解度)。给药后常规饲养,24 h内注意观察其是否出现中毒现象并及时记录下异常情况,连续观察7 d,每天1~2次,观察小鼠的采食、饮水、被毛状况、活动及精神状况等。对死亡小鼠进行剖检,于第8天断颈处死全部小鼠,剖检,观察并记录各组织器官有无异常。
1.2.3  亚慢性毒性试验:将80只昆明小鼠随机分为4组(A、B、C、D组),其中,A组为空白对照组、B组为螺旋藻粉末低剂量组[2.5 g/(kg·BW)]、C组为中剂量组[5.0 g/(kg·BW)]、D组为高剂量组[10.0 g/(kg·BW)],每组20只,雌雄各10只,分笼饲养。空白对照组:给予无添加空白饲料,连续28 d;高剂量组:给予螺旋藻粉末添加饲料(浓度为4 mg/g饲料),5 g/(只·d),连续28 d;中剂量组:给予螺旋藻粉末添加饲料(浓度为2 mg/g饲料),5 g/(只·d),连续28 d;低剂量组:给予螺旋藻粉末添加饲料(浓度为1 mg/g饲料),5 g/(只·d),连续28 d,自由饮水。
1.2.4  观察指标
1.2.4.1 临床体征:试验期间观察小鼠是否出现与药物相关的不良反应,如精神状态、呼吸、行为及排粪等情况变化。给药后观察28 d。记录小鼠不良反应出现的时间、程度、持续时间。观测的不良反应包括过敏反应、局部刺激,消化系统表现如流涎等。不良反应观察时间:对试验中出现不良反应者,应观察至症状恢复正常。
1.2.4.2  体重及饲料利用率:试验前、试验结束时对小鼠称体重。每7d于喂料前称重1次,而后计算小鼠的增重、增重率及饲料利用率。
增重率(%)=[增重(g)/试验前体重(g)]×100%
饲料利用率(%)=[增重(g)/饲料消耗量(g)]×100%
1.2.4.3  样品采集及处理:在29d时,每组小鼠断尾取尾尖血做白细胞计数及白细胞分类计数,再小鼠眼眶采血,所采血液放置于不加抗凝剂的离心管中,血液样品于室温下静置2h,然后2500 r/min离心5 min,取上层血清,置-80℃保存,用于血液生化指标分析。采血后颈椎脱臼处死,观察各组织器官有无异常,如有异常拍照并记录,如有需要可将异常组织器官固定后做病理切片观察。采集肝脏、脾脏和肾脏称重,计算肝脏、脾脏和肾脏的脏器指数。
脏器指数=脏器重(mg)/体重(g)
1.2.4.4  白细胞计数以及分类计数:用移液枪取小鼠尾尖抗凝血0.02 mL,往其中加入0.38 mL的3%乙酸溶液(同时加入1%结晶紫溶液使白细胞核着色)稀释血液,混匀,吸取少量液体加入计数池内(至计数池内刚好无空泡即可),静置1 min,显微镜观察并用低倍镜计数对角线位置上的2个大方格的白细胞总数。小鼠剪断尾尖取一小滴血做血涂片,待涂片干燥后,加入瑞士—姬姆萨染液,静置染色5~7 min,蒸馏水冲洗,烘干。低倍镜下检查涂片,观察白细胞的分布情况并选取没有红细胞层叠的区域(通常为涂片尾部即火焰部),将载玻片从最上端向最下端移动,在连续的视野中对白细胞进行分类及计数。
1.2.4.5  血清生化指标分析:按试剂盒操作测定血液中总蛋白(TP)、白蛋白(Ab)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)、肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)、总胆固醇(CHOL)、乳酸脱氢酶(LDH)、葡萄糖(Glu)含量。
1.2.4.6  病理组织学观察:在29 d采血后处死小鼠并将肝脏和肾脏浸泡于10%福尔马林溶液中,固定7 d,后流水冲洗过夜,梯度乙醇脱水,二甲苯透明,常规石蜡包埋,切片,厚度为4~4.5 μm,后进行苏木素伊红(HE)染色。切片于光学显微镜下观察。
1.2.5  统计学分析:该试验所得数据均采用SPSS 22软件中的比较均值—单因素方差分析法分析,并采用多重比较法(LSD Duncan)进行试验组间的显著性检验。结果以Means±SD表示。
2  结果与分析
2.1  半数致死量测定结果
受试小鼠经口3次灌服螺旋藻水溶液后,各剂量组小鼠饮水采食、活动及精神状况均正常,各试验组均未见死亡病例,解剖小鼠,观察各主要脏器,未出现肉眼可见的病理变化。结果表明,无法测得螺旋藻水溶液的半数致死量(LD50),故接下来进行最大耐受量试验。
2.2  最大耐受试验结果
以10 g/kg计量螺旋藻粉末灌胃后,连续观察7 d,动物全部存活,饮食正常,活动及精神状况未见异常,剖检观察主要脏器未见异常变化。
2.3  亚慢性毒性试验结果
2.3.1  临床表现:试验期间,小鼠采食饮水及活动状况均无异常,无死亡现象。
2.3.2  螺旋藻对小鼠体重、增长率及饲料利用率的影响:由表1可知,不同剂量螺旋藻添加饲料对小鼠体重的影响与饲喂常规饲料的A组相比,差异均不显著(P>0.05)。由表2可知,C组能提升小鼠的增重率,与饲喂常规饲料的A组比较差异显著(P<0.05);其他剂量组小鼠的增重率及饲料利用率与A组比较差异不显著(P>0.05)。结果表明,螺旋藻对小鼠体重和饲料利用率无影响。
         表 1  小鼠体重变化情况           g
组别 动物数(n) 给药天数
0d 7d 14d 21d 28d
A 20 18.55±1.62 26.38±2.24 28.34±2.31 30.95±3.72 33.38±3.77
B 20 18.52±1.42 24.14±2.12 26.74±2.41 29.06±3.35 32.18±2.52
C 20 17.19±1.67 25.49±1.47 27.84±2.09 30.51±2.03 32.94±2.48
D 20 17.86±1.15 24.08±2.29 27.32±2.01 27.82±2.78 33.65±2.76
 
注:同列数据肩标*表示与空白对照组相比,差异显著(P<0.05);无肩标表示与空白对照组相比,差异不显著(P>0.05)。下表同。
表2  小鼠增重率及饲料利用率
组别 动物数(n) 增重率(%) 饲料利用率(%)
A 20 0.8035±0.1886 0.1324±0.0290
B 20 0.7908±0.1388 0.1218±0.0172
C 20 0.9255±0.1477* 0.1406±0.0176
D 20 0.8875±0.1442 0.1409±0.0219
 
2.3.3  螺旋藻对小鼠脏器指数的影响:由表3可知,各剂量螺旋藻小鼠的各脏器指数与A组相比,差异均不显著(P>0.05)。结果表明,螺旋藻对小鼠的肝、肾脏及脾脏无显著影响。
表3  螺旋藻对小鼠脏器指数的影响
组别 动物数(n) 肝脏指数(mg/g) 脾脏指数(mg/g) 肾脏指数(mg/g)
A 20 44.57±3.42 5.45±1.66 11.13±1.01
B 20 42.89±5.39 4.61±1.23 10.63±2.65
C 20 47.53±6.68 5.77±1.01 10.66±2.71
D 20 43.51±4.05 4.96±0.80 11.12±2.33
2.3.4  螺旋藻对小鼠淋巴细胞的影响:由表4可知,各剂量螺旋藻小鼠的白细胞总数、中性粒细胞百分比、酸性淋巴细胞百分比、淋巴细胞百分比、单核细胞百分比均在正常范围内波动,且与A组比较差异均不显著(P>0.05)。
表4  螺旋藻对小鼠血液白细胞分类计数的影响(n=20)
项目 A B C D
白细胞总数(WBC,个/mm³) 12875±2917 11100±2732 11070±2844 11530±4402
中性粒细胞百分比(NEUT) 0.2200±0.0216 0.2275±0.0095 0.2300±0.0141 0.2175±0.0150
酸性淋巴细胞百分比(EO) 0.0125±0.0095 0.0100±0.0081 0.0125±0.0050 0.0125±0.0050
淋巴细胞百分比(LYMPH) 0.7500±0.0200 0.7525±0.0095 0.7450±0.0208 0.7525±0.0221
单核细胞百分比(MONO) 0.0175±0.0050 0.0100±0.0081 0.0125±0.0095 0.0175±0.0095
注:同行数据肩标*表示与空白对照组相比,差异显著(P<0.05);无肩标表示与空白对照组相比,差异不显著(P>0.05)。下表同。
2.3.5  螺旋藻对小鼠血清生化指标的影响:由表5可知,C组ALT值升高,与A组相比差异显著(P<0.05);D组Cr值升高,与A组相比差异显著(P<0.05);其他剂量组的TP、Ab、AKP、ALT、AST、Cr、BUN、CHOL、LDH、Glu值与A组相比差异均不显著(P>0.05)。
表5  螺旋藻对小鼠血清生物化学指标的影响
项目 A B C D
总蛋白(TP,g/L) 137.10±10.78 141.60±18.03 130.30±28.15 131.10±24.99
白蛋白(Ab,g/L) 36.840±1.755 37.430±3.335 36.510±3.758 36.300±3.252
碱性磷酸酶(AKP,金氏单位/100ml) 17.450±3.495 18.820±4.167 20.330±3.184 19.460±4.791
谷丙转氨酶(ALT,IU/L) 10.130±2.327 9.184±2.751 6.254±3.487* 10.270±2.789
谷草转氨酶(AST,IU/L) 17.500±7.291 17.020±7.367 15.680±3.955 13.090±6.497
肌酐(Cr,μmol/L) 49.410±5.306 51.180±9.873 56.060±15.440 60.860±8.647*
尿素氮(BUN,mmol/L) 4.8020±0.3930 4.5250±1.4590 5.3770±0.6935 4.9500±0.8867
胆固醇(CHOL,mmol/L) 2.7860±0.7907 2.3650±0.6172 2.3340±0.3632 2.9750±0.8263
乳酸脱氢酶(LDH,mmol/L) 628.1±214.8 589.0±203.4 741.3±195.9 543.3±230.3
葡萄糖(Glu,mmol/L) 5.427±1.060 5.793±1.014 5.962±1.288 5.653±1.713
 
2.3.6  病理组织学观察:观察各组肝脏组织切片可知,空白对照组及各给药组肝组织结构完整,肝小叶结构可辨,肝细胞结构清晰,细胞核清晰可见,相互间界限明显。观察各组肾脏切片可知,空白对照组及各给药组肾脏组织结构完整,肾小球及肾小管结构清晰可辨,细胞核清晰可见,无明显异常。

3  讨  论
螺旋藻营养成分丰富、全面、均衡,并且含有多种生物活性成分。尽管迄今为止,藻类资源的保健与功能价值研究还不够深入,但是其在免疫调节、抗癌症、抗病毒以及血液生物化学等方面的功能应用越来越受到研究人员的重视。该试验通过对小鼠灌胃不同剂量的螺旋藻水溶液进行急性毒性试验和在小鼠饲料中添加不同剂量的螺旋藻粉末进行亚慢性毒性试验,观察小鼠的临床表现、体重、增重率、饲料利用率、脏器指数、生化指标以及病理组织变化,为螺旋藻的安全性评价和临床使用安全剂量的筛选提供了一定的试验参考。
在螺旋藻半数致死量试验中,灌胃给药7 d内,各剂量组小鼠均未见死亡,采食饮水及活动状况均未见异常,按照毒理学评价标准[12],当药物的LD50>5g/kg时,该药物属于实际无毒性物质。由于无法测出螺旋藻水溶液的LD50,因此需做最大耐受量试验以反映药物的安全性。在最大耐受量试验中,20只受试小鼠在10 g/kg体重给药剂量下,7 d内均无小鼠死亡,采食、饮水及活动状况未见异常。剖检小鼠时,内脏器官均无眼观病变。说明小鼠对螺旋藻的最大耐受剂量10g/kg体重,为实际无毒。
在亚慢性毒性试验中,螺旋藻粉末分别以10.0、5.0、2.5 g/kg剂量,连续用药28 d,在观察期内未见小鼠有不良反应,精神状态良好、饮食正常。试验期间,各给药剂量组与A组(空白对照组)体重均呈稳定增长趋势,说明螺旋藻对小鼠的增重无不良影响,其中,饲喂螺旋藻粉末添加饲料5.0g/(kg•BW)组(C组)增重率显著高于A组(P<0.05),说明螺旋藻可能对机体具有一定的促生长效果,需后续进一步研究试验确证。该试验结果与李凤文等[13]、胡嘉想[14]进行螺旋藻及其相关产品的亚慢性毒性试验中,其体重、增重率、饲料利用率均无异常的结果一致。脏器指数是评价机体脏器组织状况的重要指标,白细胞总数及分类计数情况是衡量免疫功能的重要指标。结果表明,各剂量螺旋藻小鼠的各脏器指数以及白细胞分类计数与A组相比差异不显著(P>0.05),并且白细胞分类计数均在正常范围内波动,提示螺旋藻对小鼠的肝、脾、肾脏及免疫功能无显著影响。各试验组小鼠血清生化指标均在正常范围内变动,表明螺旋藻粉末分别以10.0、5.0、2.5 g/kg剂量应用时对小鼠生理生化功能无不良影响。螺旋藻粉末按10.0、5.0、2.5 g/kg剂量应用后进行病理组织学观察,发现A组及各给药组的肝组织结构完整,肝小叶结构可辨,肝细胞结构清晰,细胞核清晰可见,相互间界限明显,同样A组及各给药组的肾脏组织结构完整,肾小球及肾小管结构清晰可辨,细胞核清晰可见,因此螺旋藻对小鼠肝、肾无毒副作用,同时胡锦华等[15]、孙晓等[16]进行螺旋藻对器官毒性作用的研究时还发现,螺旋藻对肝脏以及肾脏有保护作用。
综合分析各项检测指标,表明螺旋藻实际无毒,在临床上应用是安全的。安全无毒的螺旋藻也可作为广西优势资源和新兴的农业资源加入到我国生态养殖的行列中。

参考文献略

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